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            色譜法概述

            放大字體  縮小字體 發布日期:2007-05-14  瀏覽次數:4942
            色譜法是一種重要的分離分析方法,它是利用不同物質在兩相中具有不同的分配系數(或吸附系數、滲透性),當兩相作相對運動時,這些物質在兩相中進行多次反復分配而實現分離。在色譜技術中,流動相為氣體的叫氣相色譜,流動相為液體的叫液相色譜。固定相可以裝在柱內,也可以做成薄層。前者叫柱色譜,后者叫薄層色譜。根據色譜法原理制成的儀器叫色譜儀,目前,主要有氣相色譜儀和液相色譜儀。
                色譜法的創始人是俄國的植物學家茨維特。1905年,他將從植物色素提取的石油醚提取液倒人一根裝有碳酸鈣的玻璃管頂端,然后用石油醚淋洗,結果使不同色素得到分離,在管內顯示出不同的色帶,色譜一詞也由此得名。這就是最初的色譜法。后來,用色譜法分析的物質已極少為有色物質,但色譜一詞仍沿用至今,在50年代,色譜法有了很大的發展。1952年,詹姆斯和馬丁以氣體作為流動相分析了脂肪酸同系物并提出了塔板理論。1956年范第姆特總結了前人的經驗,提出了反映載氣流速和柱效關系的范笨姆特方程,建立了初步的色譜理論。同年,高萊(Golay)發明了毛細管拄,以后又相繼發明了各種檢測器,使色譜技術更加完善。50年代末期,出現了氣相色譜和質譜聯用的儀器,克服了氣相色譜不適于定性的缺點。則年代,由于檢測技術的提高和高壓泵的出現,高效液相色譜迅遠發展,使得色譜法的應用范圍大大擴展。目前,由于高效能的色譜往、高靈敏的檢測器及微處理機的使用,使得色譜法已成為一種分析速度快、靈敏度高、應用范圍廣的分析儀器。
                在這里主要介紹氣相色譜分析法。同時也適當介紹液相色譜法。氣相色譜法的基本理論和定性定量方法也適用于液相色譜法。其不同之處在液相色譜法中介紹。典型的氣相色譜儀具有穩定流量的載氣,將汽化的樣品由汽化室帶入色譜柱,在色譜柱中不同組分得到分離,并先后從色譜柱中流出,經過檢測器和記錄器,這些被分開的組分成為一個一個的色譜峰。色譜儀通常由下列五個部分組成:
                載氣系統(包括氣源和流量的調節與測量元件等)
                進樣系統(包括進樣裝置和汽化室兩部分)
                分離系統(主要是色譜柱)
                檢測、記錄系統(包括檢測器和記錄器)
                輔助系統(包括溫控系統、數據處理系統等)

                載氣通常為氮、氫和氫氣,由高壓氣瓶供給。由高壓氣瓶出來的載氣需經過裝有活性炭或分子篩的凈化器,以除去載氣中的水、氧等有害雜質。由于載氣流速的變化會引起保留值和檢測靈敏度的變化,因此,一般采用穩壓閥、穩流閥或自動流量控制裝置,以確保流量恒定。載氣氣路有單柱單氣路和雙柱雙氣路兩種。前者比較簡單,后者可以補償因固定液流失、溫度被動所造成的影響,因而基線比較穩定。
                進樣系統包括進樣裝置和汽化室。氣體樣品可以用注射進樣,也可以用定量閥進樣。液體樣品用微量注射器進樣。 固體樣品則要溶解后用微量注射器進樣。樣品進入汽化室后在一瞬間就被汽化,然后隨載氣進入色譜柱。根據分析樣品的不同,汽化室溫度可以在50—400℃范圍內任意設定。 通常,汽化室的溫度要比使用的最高柱溫高10—50℃以保證樣品全部汽化。進洋量和進樣速度會影響色譜柱效率。進樣量過大造成色譜柱超負荷,進樣速度慢會使色譜峰加寬,影響分離效果。
                試樣中各組分的分離在色譜柱中進行,因此,色譜柱是色譜儀的核心部分。色譜往主要有兩類:填充柱和毛細管柱,現分別敘述如下:
                1、填充柱 :填充柱由柱管和固定相組成,柱管材料為不銹鋼或玻璃,內徑為2—4毫米,長為1—3米。往內裝有固定相,固定相又包括固體固定相和液體固定相兩種。
                2、毛細管往 :毛細管柱又叫空心柱,空心柱分涂壁空心柱,多孔層空心柱和涂載體空心柱。涂壁空心柱是將固定液均勻地涂在內徑0.1—0.5毫米的毛鋼管內壁而成。毛細管的材料可以是不銹鋼、玻璃或石英。這種色譜柱具有滲透性好、傳質阻力小等特點,因此柱子可以做得很長(一般幾十米,最長可到三百米)。和填充柱相比,其分離效率高,分析速度快,樣品用量小。其缺點是樣品負荷量小,因此經常需要采用分流技術。柱的制備方法也比較復雜;多孔層空心柱是在毛細管內壁適當沉積上一層多孔性物質,然后涂上固定液。這種柱容量比較大,滲透性好,故有穩定、高效、決速等優點。
             
               1、熱導檢測器熱導檢測器(Thermal coductivity detector,簡稱TCD ):是應用比較多的檢測器,不論對有機物還是無機氣體都有響應。熱導檢測器由熱導池池體和熱敏元件組成。熱敏元件是兩根電阻值完全相同的金屬絲(鎢絲或白金絲),作為兩個臂接入惠斯頓電橋中,由恒定的電流加熱。如果熱導池只有載氣通過,載氣從兩個熱敏元件帶走的熱量相同,兩個熱敏元件的溫度變化是相同的,其電阻值變化也相同,電橋處于平衡狀態。如果樣品混在載氣中通過測量池,由于樣號氣和載氣協熱導系數不同,兩邊帶走的熱量不相等,熱敏元件的溫度和阻值也就不同,從而使得電橋失去平衡,記錄器上就有信號產生。這種檢測器是一種通用型檢測器。被測物質與載氣的熱導系數相差愈大,靈敏度也就愈高。此外,載氣流量和熱絲溫度對靈敏度也有較大的影響。熱絲工作電流增加—倍可使靈敏度提高3—7倍,但是熱絲電流過高會造成基線不穩和縮短熱絲的壽命。熱導檢測器結構簡單、穩定性好,對有機物和無機氣體都能進行分析,其缺點是靈敏度低。
                2、氫火焰離子化檢測器:氫火焰離子化檢測器(Flame Ionization Detector,FID)簡稱氫焰檢測器。它的主要部件是一個用不銹鋼制成的離子室。離子室由收集極、極化極(發射極)、氣體入口及火焰噴嘴組成。在離子室下部,氫氣與載氣混合后通過噴嘴,再與空氣混合點火燃燒,形成氫火焰。無樣品時兩極間離子很少,當有機物進入火焰時,發生離子化反應,生成許多離子。在火焰上方收集極和極化極所形成的靜電場作用下,離子流向收集極形成離子流。離子流經放大、記錄即得色譜峰。
                有機物在氫火焰中離子化反應的過程如下:當氫和空氣燃燒時,進入火焰的有機物發生高溫裂解和氧化反應生成自由基,自由基又與氧作用產生離子。在外加電壓作用下,這些離子形成離子流,經放大后被記錄下來。所產生的離子數與單位時間內進入火焰的碳原子質量有關,因此,氫焰檢測器是一種質量型檢測器。這種檢測器對絕大多數有機物都有響應,其靈敏度比熱導檢測器要高幾個數量級,易進行痕量有機物分析。其缺點是不能檢測惰性氣體、空氣、水、C0,CO2,NO、S02等。
                3、電子捕獲檢測器:電子捕獲檢測器是一種選擇性很強的檢測器,它只對合有電負性元素的組分產生響應,因此,這種檢測器適于分析合有鹵素、硫、磷、氮、氧等元素的物質。在電子捕獲檢測器內一端有一個多放射源作為負極,另一端有一正極。兩極間加適當電壓。當載氣(N2)進入檢測器時,受多射線的輻照發生電離,生成的正離子和電子分別向負極和正極移動,形成恒定的基流。合有電負性元素的樣品AB進入檢測器后,就會捕獲電子而生成穩定的負離子,生成的負離子又與載氣正離子復合。結果導致基流下降。因此,樣品經過檢測器,會產生一系列的倒峰。電子捕獲檢測器是常用的檢測器之一,其靈敏度高,選擇性好。主要缺點是線性范圍較窄。
                氣相色譜法是一種很好的分離、分析方法,它具有分析速度快、分離效能好和靈敏度高等優點。但是氣相色譜僅能分析在操作溫度下能汽化而不分解的物質。據估計,在已知化合物中能直接進行氣相色譜分析的化合物約占15%,加上制成衍生物的化合物,也不過20%左右。對于高沸點化合物;難揮發及熱不穩定的化合物、離子型化合物及高聚物等,很難用氣相色譜法分析。為解決這個問題,70年代初發展了高效液相色譜。高效液相色譜的原理與經典液相色譜相同,但是它采用了高效色譜拄、高壓泵和高靈敏度檢測器。因此,高效液相色譜的分離效率、分析速度和靈敏度大大提高。就其分離機理的不同,高效液相色譜可以分為液—固吸附色譜、液—液分配色譜、離子交換色譜和凝膠滲透色譜四類。
                液—固色譜的色譜柱內填充固體吸附劑,由于不同組分具有不同的吸附能力,因此,流動相帶著被測組分經過色譜柱時,各組分被分開。液—液色譜的流動相和固定相都是液體。作為固定相的液體涂在惰性擔體上,流動 相與固定液不互溶。當帶有被測組分的流動相進入色譜柱時,組分在兩相間很快達分配平衡,由于各組分在兩相間分配系數不同而彼此分離。以非極性溶液作流動相,極性物質作固定相的液—液色譜叫正相色譜;極性溶液作流動相,非極性物質作固定相的液—液色譜叫反相色譜。離子交換色譜的色譜柱內填充離子交換樹脂,依靠樣品離子交換能力的差別實現分離。而凝膠色譜是按試樣中分子大小的不同來進行分離的。在上述四類色譜中,應用最廣泛的是液—液色譜,因此,在本節的討論中以液—液色譜為主。高效液相色譜的基本理論和定性定量分析方法與氣相色譜基本相同。高效液相色譜儀由輸液系統、進樣系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統組成。
                高效液相色譜的輸液系統包括流動相貯存器、高壓泵和梯度淋洗裝置。流動相貯存器為不銹鋼或玻璃制成的容器,可以貯存不同的流動相。高壓泵是高效液相色譜儀最重要的部件之一。由于高效液相色譜儀所用色譜柱直徑細,固定相粒度小,流動相阻力大,因此,必須借助于高壓泵使流動相以較快的速度流過色譜這。高壓泵需要滿足以下條件:能提供150—450kg/cm<SUP>2</SUP>的壓強;流速穩定,流量可以調節;耐腐蝕。目前所用的高壓泵有機械泵和氣動放大泵兩種。梯度淋洗裝置可以將兩種或兩種以上的不同極性溶劑,按一定程序連續改變組成,以達到提高分離效果,縮短分離時間的目的。它的作用與氣相色譜中的程序升溫裝置類似。
                梯度淋洗裝置分為兩類:一類叫外梯度裝置;一類內梯度裝置。外梯度裝置是流動相在常壓下混合,靠一臺高壓泵壓至色譜柱;內梯度裝置是先將溶劑分別增壓后,再由泵按程序壓入混合室,再注入色譜柱。
                一般高效液相色譜多采用六通閥進樣。先由注射器將樣品常壓下注入樣品環。然后切換閥門到進樣位置,由高壓泵輸送的流動相將樣品送人色譜柱。樣品環的容積是固定的,因此進樣重復性好。
                 分離系統包括色譜柱、連接管、恒溫器等。色譜柱是高效液相色譜儀的心臟。它是由內部拋光的不銹鋼管制成,一般長10—50cm,內徑2—5mm,柱內裝有固定相。液相色譜的固定相是將固定該涂在擔體上而成。擔體有兩類:一類是表面多孔型擔體;另一類是全多孔型擔體。
                 近年來又出現了全多孔型微粒擔體。這種擔體檢度為5—10um,是由nm級的硅膠微粒堆積而成,又叫堆積硅珠。由于顆粒小,所以柱效高,是目前最廣泛使用的一種擔體。在高效液相色譜分析中,適當提高柱溫可改善傳質,提高桂效,縮短分析時間。因此,在分析時可以采用帶有恒溫加熱系統的金屬夾套來保持色譜拄的溫度。溫度可以在室溫到60℃間調節。
                高效液相色譜的檢測器很多,最常用的有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器等。
                (1)、紫外檢測器:紫外檢測器是液相色譜中應用最廣泛的檢測器,適用有紫外吸收物質的檢測。在進行高效液相色譜分析的樣品中,約有80%的樣品可以使用這種檢測器。紫外檢測器的工作原理如下:由光源產生波長連續可調的紫外光或可見光, 經過透鏡和遮光板變成兩束平行光,無樣品通過時,參比池和樣品池通過的光強度相等,光電管輸出相同,無信號產生;有樣品通過時,由于樣品對光的吸收,參比池和樣品池通過的光強度不相等,有信號產生。根據朗伯—比爾定律,樣品濃度越大,產生的信號越大,這種檢測器靈敏度高,檢測下限約為10<SUP>-10</SUP>g/ml,而且線性范圍廣,對溫度和流速不敏感,適于進行梯度洗脫。
                (2)、示差折光檢測器:示差折光檢測器是根據不同物質具有不同折射率來進行組分檢測的。凡是具有與流動 相折射率不同的組分,均可以使用這種 檢測器。如果流動相選擇適當,可以檢測所有的樣品組分。示差折光檢測器分為反射式和沂射式兩種。反射式示差折光檢測器是根據下述原理制成的:光在兩種不同物質界面的反射百分率與入射角和兩種物質的折射率成正比。如果入射角固定,光線反射百分率僅與這兩種物質的沂射率成正比。光通過僅有流動相的參比池時,由于流動相組成不變,故其折射率是固定的;光通過工作池時,由于存在待測組分而使折射串改變,從而引起光強度的變化,測量光強度的變化,即可測出該組分濃度的變化。
                偏轉式示差折光檢測器是根據下述原理:當一束光透過折射率不同的兩種物質時,此光束會發生一定程度的偏轉,其偏轉程度正比于兩物質折射率之差。示差折光檢測器的優點是通用性強,操作簡便;缺點是靈敏度低,不能做痕量分析。此外,由于洗脫液組成的變化會使折射率變化很大,因此,這種檢測器也不適用于梯度洗脫。
                (3)、熒光檢測器:物質的分子或原子經光照射后,有些電子被激發至較高的能級,這些電子從高能級 躍至低能級時,物質會發出比入射光波長較 長的光,這種光稱為熒光。在其他條件一定的情況下,熒光強度與物質的濃度成正比。許多有機化合物具有天然熒光活性,另外,有些化合物可以利用柱后反應法或柱前反應法加入熒光化試劑,使其轉化為具有熒光活性的衍生物。在紫外光激發下,熒光活性物質產生熒光,由光電倍增管轉變為電信號。熒光檢測器是一種選擇性檢測器,它適合于稠環芳烴、氨基酸、胺類、維生素、蛋白質等熒光物質的測定。這種檢測器靈敏度非常高,比紫外檢測器高2—3個數量級,適合于痕量分析。而且可以用于梯度洗脫。其缺點是適用范圍有一定的局限性。
                離子色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術測定溶液中陰離子和陽離子的一種分析方法。離子色譜是液相色譜的一種。離子色譜是利用不同離子對固定相親合力的差別來實現分離的。離子色譜的固定相是離子交換樹脂,離子交換樹脂是苯乙烯—二乙烯基苯的共聚物。樹脂核外是一層可離解的無機基團,由于可離解基團的不同,離子交換樹脂又分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。當流動相將樣品帶到分離柱時,由于樣品離子對離子交換樹脂的相對親合能力不同而得到分離,由分離柱流出的各種不同離子,經檢測器檢測,即可得到一個個色譜峰。然后用通常的色譜定性定量方法進行定性定量分析.
                離子色譜法是進行離子測定的快速、靈敏、選擇性好的方法,它可以同時檢測多種離子,特別是對陰離子的測定更是其他方法所不能相比的。如果說高頻感應等離子光譜是同時測定多種元素的快速、準確的分析方法,那么,同時測定多種陰離子的快速、靈敏的方法便是離子色譜法了。
                離子色譜自1975年問世以來,已經得到了飛快的發展,并且引起了分析工作者的廣泛注意。目前,離子色譜法已經在能源、環境、冶金、電鍍、半導體、水文地質等方面廣泛應用,并且開始進入了與生命科學有關的分析領域。我國從80年代初期引進離子色譜儀,開始了離子色譜的應用研究工作,同時也開始了儀器的研制,目前已能生產離子色譜儀。隨著離子色譜技術的發展,離于色譜儀在我國的應用將日益普及。
                (1)、離子交換平衡 離子色譜中使用的固定相是離子交換樹脂。離子交換樹脂上分布有固定的帶電荷的基團和能游動的配位離子。當樣品加入離子交換色譜往后,如果用適當的溶液洗脫,樣品離子即與樹脂上能游動的離子進行交換,并且連續進行可逆交換吸附和解吸,最后達到吸附平衡。
                (2)、化學抑制型離子色譜工作原理 待測樣品由流動相帶入分離柱,由分離柱將不同離子分開,由檢測器得色譜峰。但是,用于離子色譜的洗脫液,一般都是強電解質溶液,其電導值一般較待測離子高2—3個數量級,如果用電導檢測器檢測待測離子,待測離子信號將完全被洗脫液所淹沒。為了解決這一問題,采取色譜法是有機物的有效分離分析方法,特別適用于進行有機物的定量分析,但定性分析比 較困難。質譜法擅長定性分析,但對復雜的有機混合物分析則無能為力。如果把二者結合起來,則能發揮兩種儀器各自的優點。因此,目前所有的質譜儀都與氣相色譜相連。組成氣相色譜—質譜聯用(GC—MS)系統。
                該技術是在50年代后期開始研究的。到60年代后期已經成熟并出現了商品儀器。色譜儀是在常壓下工作,而質譜儀是在高真空下工作,因此,必須有一個連接裝置,將色譜流出的載氣去掉,使壓強降低,樣品氣進入 離子源。這個連接裝置叫分子分離器。目前一般使用噴射式分子分離器,樣品氣和載氣(He)一起由色譜柱流出進入分子分離器。由于載氣分子量小,擴散快;經過噴咀后,很快擴散開并被抽走。樣品氣分子量大,擴散慢 ,依靠慣性進入質譜儀。這樣,經過分子分離器后,載氣被抽除,實現了載氣和樣品氣的分離。如果色譜儀使用毛細管柱,由于毛細管柱流量很小,可以不必經過分子分離器而直接進入離子源 。這樣,混合物樣品由色譜儀一個一個分開,由質譜儀一個一個鑒定,并且根據需要由數據系統進行數據處理,快速地得到各種信息。因此,GC—MS系統已成為有機物分析的重要工具。第十三課 液質聯用液相色譜—質譜聯用 對于熱穩定性差或不易汽化的樣品,使用GC—MS有一定的困難。因此,近年來又發展了液 相色譜—質譜(LC—MS)聯用技術。LC和MS連接的主要問題是如何去除溶劑。目前應用較多的接口裝置有傳送帶式和熱噴霧式兩種。
                傳送帶接口是依靠不銹鋼或高聚物的傳送帶將樣品送入離子源。在傳送過程中,溶劑被加熱汽化并用泵抽走,樣品在離子源汽化并電離,這種接口適用于非極性溶劑。對于極性溶劑,由于汽化慢,需要分流,因而樣品利 用率低,影響了整個系統的靈敏度。 熱噴霧接口是80年代發展起來的新的接口裝置。這種裝置包括汽化器、電窩室和抽氣系統三部分。汽化器是一根金屬毛細管,內徑約0.15mm,毛細管采用直接電加熱法加熱。電 離室有發射電子的燈絲和放電電離裝置。抽氣系統主要是一個機械泵,有的加冷阱,目的為了捕集溶劑。 熱噴霧接口的電離方式有三種:直接熱噴霧電離、放電電離和電子束電離。熱噴霧電離是 在流動相中加入電解質(如醋酸銨),當流動相通過加熱的汽化器后,以接近汽化(或部分汽化)的狀態從毛細管噴出,形成合有細微霧滴的氣流,因為溶液中合有電解質,溶液中就含有一定量的離子,微小霧滴因而帶電。隨著霧滴的不斷蒸發變小,形成局部強電場,發生場解吸電離。場解吸電離生成的溶劑離子和樣品離子還可以通過離子分子反應生成新的離子。此外,還可以利用放電電離和電子束使熱噴霧氣流產生化學電離。先使溶劑分子電離,然后與樣品分子反應生成樣品離子。電離生成的離子進入分析器,溶劑氣體由抽氣系統抽出。 熱噴霧方式的特點:
                (1)、直接熱噴霧電離產生的樣品離子一般為質子化的離子或所加陽離子與樣品分子的合成離子。這種電離方式比化學電離溫和,譜圖往往有較強的準分子離子。因而更適用于難汽化和熱不穩定樣品的分子;
                (2)、能滿足一船液相色譜流量要求,100%的水也能分析;
                (3)、有良好的色譜分辨率,靈敏度等于或優于傳送帶方式;
                (4)、需加入電解質,操作麻煩,結構信息少,適合于四極質譜而不適合于磁質譜。
                以上兩種聯接裝置,雖然使液相色譜和質譜的聯用成為可能,但都有不足之處。目前正在發展中的超臨界流體色譜(SFC)和質譜(MS)聯用,可能是對難揮發、易分解物質進行聯用分析最有前途的方法。
                質-質聯用質譜—質譜聯用 80年代初,在傳統的質譜儀基礎上,發展了質譜—質語(MS—MS)聯用技術。它和GC—MS不同,GC—MS是依靠GC將混合物分離,然后由MS定性。而MS—MS則是依靠第一級MS分離出特定的離子,經過碰撞活化后,再依靠第二級MS進行定性分析。質譜—質譜聯用方式很多,既有磁式質譜—質譜聯用,如BEB型、EBE型、BEBE型(B:磁分析器,E:靜電分析器),又有四極質譜—質譜聯用,如QQQ型(Q:四極場),也有混合質譜項譜聯用,如EBQQ型。無論哪種類型的聯用,都采用了碰撞誘導分解(CID)技術。 質譜—質譜聯用技術對于有機物結構研究是非常有用的。利用它可以進行于離子掃描、母離子掃描以及中性丟失掃描。子離子掃描可以用來研究某個 化合物的結構;母離子掃描則用以研究一組相關的化合物;而中性丟失掃描?梢栽趶碗s的混合物中,尋找現有相同官能團的系列化合物。同時,采用MS—MS技術還可以直接進行混合有機物的分析。由第一級MS選擇復雜 混合物中的特定離子,碰撞活化后由第二級MS定性測定。另外,對于分子量大的熱不穩定的化合物,可以利用場解吸—質譜—質譜(FD—MS—MS)或快原于轟擊—質譜—質譜(FAB—MS—MS)聯用方法,充分發揮MS—MS聯用的優勢

             
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